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敌草快(1，1'-亚乙基-2，2'-联吡啶二溴盐)是一种作用迅速的非选择接触除草剂和植物脱水剂，与广泛应用的百草枯(1-1-二甲基-4-4-联吡啶阳离子盐)属于同一类。近年来，百草枯水剂被禁止在国内销售，敌草快在国内除草剂市场随之销售量剧增，敌草快中毒的病例报告相应明显增加。敌草快中毒多见于发展中国家的农村，目前国内尚缺乏发病率的统计数据。敌草快中毒的大多数患者死于并发症，如消化道并发症(腹胀、组织脱水、胃肠道粘膜损伤、麻痹性肠梗阻、低血容量性休克等)、心脑血管并发症(脑干出血和梗塞、左心室乳头肌梗塞)和肾小管严重损伤等多个器官衰竭，涉及循环和呼吸系统［1］。现将敌草快的毒理学研究进展综述如下。 1 毒理学特点 1.1 理化性质 敌草快(Diquat，DQ)，别名藻酸盐，二溴盐，化学名称是1，1'-亚乙基-2，2'-联吡啶二溴盐，分子式为C12H12N2Br2，以单水化合物形式存在，是一种淡黄色晶体，在325℃以上分解。其相对分子质量为343.8，不溶于非极性有机溶剂，微溶于乙醇和羟基溶剂，在水中的溶解度为700g/L。敌草快的水解过程符合一级动力学方程，其在中性和酸性溶液中稳定，在碱性溶液中易发生水解且水解速率随温度升高而加快［2］。在pH=7条件下模拟光照DT50=74d［3］。敌草快是1957年由英国首次在世界上开发应用的，是一种作用迅速的接触除草剂和植物脱水剂。敌草快具有良好的除草效果，是一种非选择性除草剂，通过被绿色植物组织吸收产生过氧化自由基而发挥作用，因此在世界各国被广泛应用。 1.2 毒理学资料 按我国农药毒性分级标准，敌草快属于中等毒性除草剂。大鼠经口摄入敌草快的LD50为231mg/kg，小鼠LD50为125mg/kg，对眼睛和皮肤具有刺激性［4］。敌草快在胃肠受细菌作用而降解，故其经胃肠吸收少，吸收后随血流分布至全身器官、组织。虽然敌草快在各组织和体液分布不均，但在任何特定组织的分布模式非常相似，其中以肝肾浓度较高。其代谢产物自由基和脂质过氧化物等的毒性较其原形低，主要通过肾排泄，亦有相当量通过胆汁排泄。有报告显示，观察到尿百草枯、敌草快的减少没有区别，但是胆汁中敌草快浓度较高，表明胆汁可能是长期摄入后降低血清和人体组织中敌草快浓度的有效因素之一［5］。给大鼠静脉注射敌草快(30mg/kg)3h后，在大鼠肾小管和肾小管上皮细胞中即可检出敌草快，但在肾小球中不能检出;注射12h后，可观察到肺部出现含有敌草快的巨噬细胞，并且持续到第7天; 静脉注射3～7d，心肌细胞免疫组织化学染色呈阳性［6］。敌草快对人的致死量为6～12g，摄入后对生物体的还原－氧化活性影响很大，经口摄入敌草快时，初期临床表现为口腔、食道等消化系统的糜烂、溃疡，随后对肺、心、肝、肾等都有毒害并引起脏器功能衰竭，严重者会引起突然死亡。敌草快还能导致胎儿畸形［7］。 2．临床表现 Wood等［8］报告了第1例敌草快吸入后，病人出现高烧、咳嗽、胸部X线改变合并黄疸、皮疹等中毒表现，也是第2 例由吸入联吡啶除草剂气雾剂引起的中毒。Schmidt等［9］报告了一个28岁的男性摄入除草剂敌草快。病人迅速出现严重的胃肠代谢紊乱，呼吸衰竭，肾功能衰竭，血流动力学紊乱，癫痫发作，而且测定了血清肌酐和血清敌草快浓度，为综合治疗方案的制定提供了帮助。Ｒudez等［10］报告了1例自己把敌草快浓缩液20ml放入阴道后引起中毒的病例。患者第一个24h即出现腹痛、呕吐、腹泻、胸部灼烧痛、嗜睡和外阴及阴道腐蚀性炎症。在第3天出现急性肾衰竭，6d内患者进行6次血液透析治疗，3个月后患者出现痉挛性四肢轻瘫合并构音障碍。患者第3天脑电图检查出现弥漫性慢波改变，第28 天恢复正常。神经－肌电图始终正常。在中毒后第57 天进行的周围神经活检显示，没有髓鞘或轴突改变。1999年Tanen［11］报道了1例66岁的男子口服高硼酸钠工业用除草剂浓缩液200ml，其中敌草快含量占1.84%。患者口服后8h无症状，随后出现喉咙痛和呕吐，摄入20h后，出现食管炎、口腔黏膜炎、会咽炎和进行性急性肾衰竭，经过积极治疗患者最终完全康复。文献中还有报告敌草快中毒导致腹胀、组织脱水、胃肠道粘膜损伤［12］、麻痹性肠梗阻、低血容量性休克等，更为严重的一例报告是一名64岁男子敌草快中毒18d后身亡，尸解发现脑干出血和梗塞、支气管肺炎、左心室乳头肌梗塞和肾小管损伤［13］。 Kibby和Ｒing［14］对一家农药包装公司的员工进行了调查，6名员工的指甲出现缺陷，包括指甲变色、凹陷和脱落。工人作业时使用了多种杀虫剂和除草剂，包括敌草快。该案例报道提到，1975年以前有6篇文章记录了与百草枯、敌草快或其他除草剂有关的类似的指甲改变，而1985年后只有一篇类似的案例报告。而敌草快是唯一一种在前期文献中报道会导致指甲缺陷，也在该调查中使用过的农药。因此，敌草快暴露是对这些工人的指甲变化的最合理解释。另外，1990年Manoguerra［15］报道1例足底长时间暴露于敌草快后需要植皮的脚全厚度烧伤病例。Adams等［16］报道1例少见的、生产过程中敌草快致口腔黏膜损伤的病例。 3 发病机制 3.1 氧化应激损伤 敌草快和百草枯均为非特异性脱叶剂，会在许多器官中引起毒性，包括肺、肝、肾和大脑。这种毒性被认为是由活性氧(ＲOS)产生的。产生ＲOS等化合物中的重要途径之一是氧化还原循环。在关于敌草快和百草枯氧化还原循环的研究中，研究者使用人类重组的细胞色素P450还原酶和中国的仓鼠卵巢(CHO)细胞，构建了过表达细胞色素P450还原酶的细胞(CHO-OＲ)和野生型(CHO-WT)对照细胞。在过表达细胞色素P450还原酶和微体的细胞中进行氧化还原测定，与百草枯相比，暴露于敌草快生成ＲOS的效率是百草枯的10～40倍。相比之下，在饱和浓度的条件下，这些化合物对于重组酶和微体的氧化还原循环显示类似的活性。敌草快和百草枯同样参与了CHO细胞中的氧化还原循环。在CHO-OＲ细胞中比CHO-WT细胞有更明显的活性，敌草快在CHO 细胞中的氧化还原循环与蛋白质羰基形成(一种蛋白质氧化的标志)显著增加相关;使用氧传感器测量细胞氧耗，也得到了相似结果。这些数据表明，在敌草快的氧化还原循环过程中，ＲOS的形成会产生氧化应激。在氧化还原循环过程中，提高氧的利用率可以减少代谢反应的细胞内供氧最终引起毒性损伤［17］。一般认为百草枯、敌草快对肾的损伤是通过ＲOS的产生［18］。与以往的研究一致，敌草快在微粒体氧化还原循环过程中产生的ＲOS，以及在重组细胞色素P450还原酶细胞中产生的ＲOS，比百草枯更高效［19］，值得思考的是，因为除草剂的毒性取决于它们被摄取到靶细胞和含细胞色素P450还原酶或能介导氧化还原循环的其他酶的细胞中的含量，而在不同组织中，敌草快和百草枯毒性不同是公认的观点［20］。因此，鉴于敌草快主要损害的脏器是肝和肾，而百草枯主要导致肺损伤和纤维化，这可能是由于毒物选择性吸收到组织的浓度不同而导致的［21］。 总之，既往研究表明，敌草快和百草枯在人类和小鼠肝微粒体细胞色素P450还原酶重组细胞中，介导了氧化还原循环过程，参与了NADPH生成ＲOS和氧依赖的过程。在完整的CHO细胞中，敌草快和百草枯增加了氧的利用率，诱导氧化应激，并能减少细胞内氧代谢过程。与百草枯相比，敌草快除了增加氧化还原循环，还可能导致组织选择性毒性;然而，这取决于组织内除草剂的局部浓度、氧化还原循环能力以及抗氧化防御机制。也不能排除联吡啶除草剂介导毒性替代作用的可能性。例如，在角质形成细胞的氧化还原循环中，百草枯刺激可诱导抗氧化的表达，包括铜、锌、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽-S-转移酶(血红素氧合酶-1和几个GSTP1、GSTA3和GSTA4)，在适应性反应中减轻了敌草快和百草枯诱导的氧化应激。因此，需要进一步的研究来确定在CHO细胞中的抗氧化表达发生类似的变化以及它们介导氧化还原循环过程［17］。 氧化应激会引起一种适应性的抗氧化反应，这种反应随组织类型而变化。敌草快是一种强力的氧化还原物质，能产生活性氧自由基，被用于研究氧化应激，然而，它对抗氧化系统的影响并没有在神经元细胞中得到发现。有研究发现，敌草快抑制了神经母细胞瘤细胞的生长，并诱导了一种适应性的抗氧化反应，这种反应是浓度依赖性的，并能在亚致死浓度下发生。在高浓度时，敌草快改变了线粒体功能，并使其毒性增强［22］。 Ｒogers等［23］利用一种不表达谷胱甘肽还原酶的小鼠，Gr1(a1Neu)(Neu)小鼠，研究了敌草快诱导的氧化损伤的作用。结果表明，敌草快在缺乏谷胱甘肽还原酶的小鼠上诱导的肾损伤，为研究ＲOS诱导的肾坏死和谷胱甘肽还原酶在抵御氧化剂造成损伤方面提供了一种有用的动物模型。 敌草快通过进行氧化还原循环过程可以产生超氧阴离子自由基，因此，敌草快已被报道广泛用于动物体内氧化应激诱导，从而影响生长性能和营养代谢［24］。2012年Lv等［25］发现10mg/kg敌草快显著提高血清MDA 浓度和抑制抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性。 研究表明敌草快体内注射后显著破坏氧化平衡，明显降低血清NO水平，增加血清MDA浓度。百草枯和敌草快促进了生物系统中超氧阴离子的形成，脂质过氧化被认为是其毒性机制［26］。实验表明，百草枯对缺硒小鼠的毒性高于对照组，可能因为该小鼠体内硒酶谷胱甘肽过氧化物酶的活性降低。研究通过测定完整动物的乙烷产率来测量脂质过氧化，通过存活率和通过组织学和血清酶学指标评估肝和肾坏死的毒性。百草枯和敌草快对缺硒大鼠的毒性比对照组高。敌草快(19.5μmol/kg)引起缺硒大鼠肝和肾的快速大量坏死和极高的乙烷产率。给予对照组大鼠急性致死剂量百草枯(390μmol/kg)和敌草快(230μmol/kg)，乙烷生产极少，并且没有肝坏死迹象。这些结果显示，百草枯和敌草快主要通过缺硒大鼠脂质过氧化发挥其急性毒性。硒对红细胞的超氧化物歧化酶活性无影响。谷胱甘肽过氧化物酶是在动物体内唯一能够良好表征硒生化功能的物质，解释了硒对抗敌草快大鼠的脂质过氧化和毒性的保护作用。低硒大鼠注射50 倍硒后后给予敌草快(19.5μmol/kg)。10h内，硒对敌草快脂质过氧化和死亡提供了重要保护，尽管这种治疗并没有导致肝、肾、肺或血浆中谷胱甘肽过氧化物酶活性上升，这提示除了谷胱甘肽过氧化物酶之外还存在一个保护脂质过氧化的硒因子。 3.1.1 肺组织氧化应激损伤: Varga等［27］发表了关于单次给予亚中毒剂量的敌草快所引起大鼠损害的研究报告。敌草快给药第1天显示肺中浓度最高，但在两周后肺中不能检出敌草快。在第1天和第3天，肝中过氧化物酶活性和过氧化物酶体的数量也显著增加。给药后第1天观察到肺泡表面张力及毛细血管通透性的增加，随后可见肺泡I和II型上皮细胞退行性改变、局灶性出血水肿和肺泡巨噬细胞的存在。在第2周和第4周，轻微的肺纤维化仍然提示肺损伤。对于肾小管毒性损伤则表现为溶酶体再生数量增多。 Witschi和Kacew［28］给大鼠分别注射156mmol/kg百草枯及140mmol/kg敌草快，1h内，发现肺内的NADPH和NADP比率急剧下降。这一效应持续了至少24小时。电子显微镜下观察到，百草枯和敌草快均可损伤肺泡I型细胞，但只有百草枯使肺泡II型细胞产生病变。Manabe和Ogata［29］评估了大鼠气管内给药敌草快后，不同时间间隔对肺的毒性影响。敌草快注射后12h，I型和II型肺细胞都发生了退化性变化，与百草枯诱导的损害相似。然而，与百草枯相比，相同的损害需要更大剂量的敌草快，百草枯可以由肺部主动吸收。形态学证据表明，尽管没有被肺吸收，但敌草快的肺损伤机制可能与百草枯相同。敌草快最初引起的是肺泡损伤，紧随其后的是与百草枯类似的肺纤维化。由于百草枯是一种众所周知的致肺纤维化毒物，这2种药物在肺泡损伤中的共同特性可能会解释肺纤维化发展过程中的关键机制。 Wong和Stevens［30］进行了百草枯和敌草快对肺泡巨噬细胞毒性的比较研究。成年大鼠肺泡巨噬细胞体外接触百草枯或敌草快均会导致浓度依赖的细胞毒性(细胞死亡)。虽然百草枯对巨噬细胞的影响显著大于敌草快，但敌草快进入巨噬细胞的程度大于百草枯。以耗氧损失量衡量，细胞呼吸对敌草快的敏感性高于百草枯。此外研究发现，只有百草枯的细胞毒性依赖于氧含量，并可以因培养液中是否存在抗氧化酶而改变。然而，这2种化合物对纯化的线粒体效果是同等的。百草枯和敌草快均能作用于氧化磷酸化，并诱导产生ＲOS、超氧阴离子和过氧化氢。研究结果提示，自由基是最可能的作用机制，而对巨噬细胞来说，百草枯具有细胞毒性，而敌草快中毒可能存在于其他的作用模式。 3.1.2 肝组织氧化应激损伤: 敌草快的毒性作用参与铁介导的氧化应激反应，然而其作用机制尚不清楚。Higuchi等［31］研究了敌草快诱导铁代谢雄性Fischer344大鼠氧化应激反应，尤其侧重于基因表达方面。在敌草快处理20h内，肝非血红素铁含量不变。在染毒早期阶段后，肝游离铁水平显著提高，保持升高至少6h，导致严重的肝毒性，并持续到敌草快染毒后20h。由于肝铁蛋白水平尤其是H-亚基增加，在敌草快染毒后20h内持续增长，它导致肝铁蛋白重链mＲNA表达升高。这些铁离子随后被氧化应激条件下的铁蛋白合成所隔离，从而限制了铁的氧化反应。在敌草快染毒6～20h，血浆铁浓度下降，而血浆IL-6水平在染毒后3～20h明显增加。敌草快染毒组大鼠肝铁调素mＲNA的表达在3和6h显著上调，而膜铁转运蛋白mＲNA在20h 表达略下调。在3、6和20h，转铁蛋白受体1mＲNA表达明显上调。这些结果表明，抑制铁的存储组织释放铁，通过对白细胞介素6-铁调素-铁转运蛋白轴的刺激，增强由转铁蛋白受体1介导肝细胞对铁的摄取，可降低血清铁。 3.1.3 线粒体抑制: 有证据表明帕金森病(PD)，除了具有遗传病因素之外，环境因素在疾病的发病和发展中也发挥作用。多数情况下，引起PD的任何环境因素的具体发病机制尚不清楚。由于它与已经在欧盟停止注册的农药百草枯的有相似之处，Nisar等［32］在体外研究了敌草快引起相关PD样细胞的死亡能力。敌草快显示出对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和人的中脑神经元细胞比百草枯和四氢吡啶更强的毒性，这种毒性与多巴胺转运介导的吸收无关。敌草快可以通过ＲIP1 激酶导致细胞死亡，不依赖于半胱氨酸蛋白酶(caspase)激活，细胞凋亡中在其中只起很小的作用，并伴随着线粒体呼吸系统复合物I 无抑制作用的情况下增加的ＲOS的产生。在24h或4周的暴露后，观察到的人突触核蛋白表达变化。因此，敌草快可能通过程序性坏死而不是细胞凋亡来杀死神经组织，这反映了在高水平敌草快暴露后所看到的病理变化，尽管其促进PD的能力尚不清楚。 PD是一种最常见的与年龄有关的神经退行性疾病，并影响到全世界数百万人。强有力的证据表明氧化应激和线粒体功能障碍在PD病发病机制中的作用。最近的流行病学和毒理学的研究表明，环境因素，特别是除草剂百草枯和敌草快，是与帕金森病相关的神经毒物。Singh等［33］研究探讨了假马齿苋的标准提取物对百草枯和敌草快引起的神经毒性的保护机制。研究结果表明，假马齿苋可以通过调节PD 病中发生改变的细胞氧化还原途径来保护大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株PC12 细胞，并有可能在预防帕金森病的过程中起治疗作用。 3.2 诱导细胞凋亡 关于敌草快对女性生殖系统，特别是卵巢功能的毒性影响很少。慢性接触敌草快会降低卵巢重量，诱导卵巢氧化应激，导致颗粒细胞凋亡，并影响卵母细胞的发育能力，表现为ＲOS的积累，并增加了细胞凋亡相关基因的表达。此外，经敌草快处理后，与对照组小鼠相比，胎鼠和产仔数量显著减少。慢性暴露于敌草快可通过促进细胞和卵巢的ＲOS产生，阻碍卵泡发育、诱导细胞凋亡和降低卵子质量，对雌性小鼠产生生殖毒性。敌草快可以作为一种有效的化学物质，用于体内研究氧化应激诱导的雌性生殖毒性［34］。 3.3 肠道损伤机制 长期摄入外源性化学物质可以引起胃肠疾病。Anton等［35］研究发现急性小剂量胃管内注射食品污染物敌草快可以引起肠道分泌肥大细胞和一氧化氮。这项工作的目的包括在大鼠体内研究:(1)低剂量(0.1mg/kg·d口服)敌草快对胃肠免疫细胞的影响;(2)一氧化氮合酶(NOS)在这些影响中发挥的作用。研究发现敌草快长期低水平的摄入会引起低水平的胃肠和肠道炎症，并增加小肠的活动。 4 实验室检测 可用半定量比色方法检测人尿中敌草快，制备10种浓度的敌草快除草剂溶液和含有尿液和草甘膦的对照尿样标本，使每个标本的原始溶液有颜色变化，通过肉眼观察起始和30min后颜色的变化强度。在所有样品中检测到浓度依赖强度的绿色，其中敌草快溶液浓度范围从0.73～730mg/l，这种比色效应在30min后消失。碳酸钠/连二亚硫酸盐试验可能作为一种定性的床边检查，在适当的临床环境中检测尿中敌草快［36］。敌草快属于季铵盐阳离子，分子量较小，精准检测方法有液相色谱法(HPLC)［37］、固相萃取－HPLC法［38］、气相色谱法(GC)［39］、液相色谱质谱联用法(LC．MS)［40］、气相色谱质谱法(GC．MS)［41］、电泳法［42］、分光光度法、紫外分光光度法和二阶导数光谱法［43］等。 5 治疗 Powell等［44］较早报道了一名儿童的血液灌注，一个2岁半的男孩不小心吞下了敌草快，中毒143d后死亡，在死亡之前出现进行性神经功能障碍，尸检时发现有脑梗和紫癜，与7名死于敌草快中毒的成人其中3人的脑干病理非常相似，患儿肾、肠胃和肺的损害也与成人摄入敌草快后的情况相似。患儿一共做了6次血液灌流。百草枯和敌草快混合中毒治疗包括口服漂白土、强力利尿、血液灌流、N-乙酰半胱氨酸、甲基强的松龙、环磷酰胺、维生素E、秋水仙碱、延迟连续吸入一氧化氮。随后病人恢复，肺功能正常，结果的确令人鼓舞［45］。 敌草快中毒的治疗目前尚无特效药物，以清除毒物、促进代谢、保护脏器、对症支持治疗等综合治疗为主。血液净化治疗如血液透析(HD)、血液灌流(HP)、持续性血液净化(CＲＲT)等，但是对于敌草快中毒，哪种净化方法更有效尚无系统研究报道。早期足量、脉冲式应用激素可在一定程度上抑制炎症和预防肺纤维化，积极对症治疗可减少脏器功能损害，常用的保护肝肾功能的药物有免疫抑制剂、抗自由基和抗炎类等。在1968～1999年期间，只有30例敌草快中毒的病例报告，其中13例(43%) 死亡。敌草快中毒可引起局部和全身损害，系统损害特点与摄入方式有着必然的联系。严重中毒的患者可出现胃肠黏膜溃疡、麻痹性肠梗阻、低血容量性休克、急性肾功能衰竭、昏迷等表现。对于经过使用尿液定性测定快速确诊敌草快口服中毒患者，中毒1h内应考虑给与肠道去毒，然后采取包括液体和电解质置换的支持性治疗措施。虽然血液透析和血液灌流是公认有益的治疗方法，但是对于已经确诊肾衰竭的敌草快患者，目前尚没有足够的临床证据表明，血液透析或血液灌流可以清除大量的敌草快、减少器官衰竭的风险和防止致命的结果［46］。 敌草快是一种通过氧化还原循环产生超氧化物的除草剂。Nrf2 是一种转录因子，可以调节细胞的保护基因，以应对氧化应激。Wu等［47］研究了Nrf2对敌草快诱导毒性的保护作用，结果发现Nrf2在预防肝和肺损伤方面起着重要的作用，这一保护作用是由Nrf2调控的细胞GSH和GSH合成基因表达所完成的。 6 小结 敌草快属吡啶类化合物，是一种非选择性除草剂，因其成本低、起效快、低污染，得到广泛利用。临床上敌草快中毒可引起局部腐蚀及脏器功能损害。其发病机制目前以氧化还原反应形成ＲOS及脂质过氧化为主，国内鲜有文献报道研究敌草快中毒机制的文章。目前也无特效治疗的药物，治疗上以清除毒物、保护脏器功能等综合治疗为主。随着百草枯逐渐退出中国除草剂市场，且实验表明，经配制的敌草快被证明可有效替代百草枯，并可以作为更环保的替代品和有可比性的除草剂［48］，因此敌草快中毒将越来越成为我国一个值得关注的公共卫生事件。 参考文献（略） 文章来自：毒理学杂志2018年10月第32卷第5期413-419页，DOI:10.16421/j.cnki.1002-3127.2018.05.016
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