作者单位:325000 浙江温州医学院附属第一医院急诊科(邱俏檬、何国鑫、卢中秋), 温州医学院药理学教研室(胡国新)

通信作者:卢中秋

【摘要】　目的　探讨氟虫腈对小鼠的急性毒性及地西泮和苯巴比妥钠的治疗效果。方法　分别以6个剂量的氟虫腈灌胃染毒, 观察急性中毒后小鼠行为改变、重要脏器的病理形态学改变及死亡情况;应用免疫组织化学和显微图像技术检测中毒小鼠大脑谷氨酸及γ-氨基丁酸(γ-GABA)阳性神经细胞的分布和含量。小鼠经氟虫腈(90mg/kg)灌胃0.5h后腹腔注射地西泮和苯巴比妥钠,观察并比较各治疗组小鼠的死亡时间和生存率。结果　各剂量组小鼠均出现抽搐等中枢神经系统兴奋症状;电镜下可见大脑海马区神经元细胞核膜间隙轻度扩张,神经胶质细胞空泡化,神经纤维呈脱髓鞘样改变;与对照组相比,氟虫腈急性中毒小鼠大脑皮质的谷氨酸平均阳性细胞数目(N)和阳性细胞面积比(Aa%)明显增加,但皮质和海马CA1区GABA阳性细胞的N和Aa%与正常组比较无明显差异。地西泮、苯巴比妥钠治疗后小鼠生存率均为58%。结论　氟虫腈急性中毒小鼠主要表现为中枢神经系统兴奋症状,造成中枢神经细胞的损害,免疫组织化学提示该改变可能与中枢神经系统谷氨酸递质过度表达有关;早期应用地西泮、苯巴比妥钠对氟虫腈急性中毒小鼠有较好的治疗效果。

氟虫腈(fipronil)的化学名称为5-氨基-1-(2,6-二氯-4-三氟甲苯基)-4-三氟甲基-亚磺酰基吡唑-3-腈,为苯基吡唑类杀虫剂,具有杀虫谱广、效果高等特点,已在全球广泛应用。我国近几年逐步推广应用,由氟虫腈引起急性中毒的临床病例陆续报道^[1.2],但有关氟虫腈急性中毒的毒性、毒理以及有效解毒药物尚未见报道。我们通过动物实验初步观察氟虫腈的毒性、毒理特点以及药物疗效,为今后进一步深入研究氟虫腈急性中毒以及为该类急性中毒的临床诊断与治疗提供可靠依据。

材料与方法

一、实验动物与材料

实验动物采用清洁级ICR品系小鼠160只,体重为(20.6±2.9)g,雌雄各半,由温州医学院实验动物中心提供。5%氟虫腈(Regent,批号40616012452)由杭州拜耳生物公司提供, 地西泮(批号040713)由江苏仁川制药有限公司提供,苯巴比妥钠(批号0208191)由天津金耀氨基酸有限公司提供,γ-氨基丁酸(γ-GABA)多克隆抗体、谷氨酸多克隆抗体、二甲二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、即用型链霉素-卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法(SABC)染色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。

二、实验方法

1.急性中毒的观察:清洁级ICR品系小鼠60只,雌雄各半,按随机表法分为6组,每组10只。分别以29.4、36.8、46.0、57.6、72.0及90.0mg/kg的5%氟虫腈灌胃染毒后观察7d,记录行为变化和死亡情况。行为观察参考Fatholahi标准^[3]。光镜及电镜下观察氟虫腈急性中毒小鼠主要脏器病理及超微结构改变情况。

2.中枢神经系统谷氨酸和GABA的检测:46只小鼠按随机表法分成2组,其中对照组6只,予生理盐水1ml灌胃;染毒组40只,5%氟虫腈112mg/kg灌胃。观察24h,选取达到Fatholahi^[3]抽搐标准中Ⅳ～Ⅴ级的存活小鼠12只与正常对照组小鼠6只,以10%水合氯醛麻醉后,经左心室刺入升主动脉,先用4℃生理盐水20ml快速灌注,后灌注含4%多聚甲醛、1%戊二醛的0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)50ml,灌注15min。将脑组织固定于不含戊二醛的上述灌注液中24h以上,石蜡切片。取皮质和海马最大断面的切片行免疫组织化学SABC染色,方法见文献^[4]。取每只小鼠大脑皮质和海马CA1区切片各2张,用图像分析仪对γ-GABA或谷氨酸阳性细胞进行分析,棕黄色至黄色为阳性细胞,分别测量平均阳性细胞数(N)和阳性细胞面积比(Aa%)。

3.治疗效果的判定:ICR小鼠36只,雌雄各半,按随机表法分成3组,每组12只,予5%氟虫腈90.0mg/kg灌胃,染毒后0.5h时分别腹腔注射生理盐水、地西泮和苯巴比妥钠,地西泮剂量为每8h给10mg/kg,苯巴比妥钠剂量为每8h给25mg/kg。观察小鼠死亡时间(染毒后以h计算)和120h小鼠的存活数,判断治疗效果。

4.统计学处理:计量资料用均数±标准差表示,采用SPSS10.0统计软件包进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.小鼠氟虫腈经口急性中毒表现:各剂量组中毒小鼠在染毒后0.5～2h即表现为易激惹,四处奔窜,心跳加快,呼吸急促,死亡前均有不同程度的阵发性抽搐;随剂量增大抽搐加重,90.0mg/kg剂量组给药30min左右即可出现抽搐,表现为惊恐、弓背抬高、尾巴及体毛竖立等,死亡小鼠临死前均发生发绀。死亡时间在1～2d,第4天后未见小鼠死亡。中毒小鼠大体可见全胃扩张、胃壁变薄。光镜下可见胃窦黏膜层淋巴细胞浸润,肺脏间质可见散在炎症细胞浸润,脑组织轻微水肿样改变。大脑海马的超微结构改变主要表现为细胞核膜间隙轻度扩张,神经胶质细胞空泡化,突触间隙轻度扩张,神经纤维髓鞘松解,呈早期脱髓鞘改变。

2.中枢神经系统谷氨酸和GABA免疫阳性细胞表达:与正常对照组比较, 氟虫腈染毒组大脑皮质的谷氨酸免疫阳性细胞的N和Aa%均有明显增高(t值分别为-9.64,-10.57,P<0.01),见表1及图1,2;但海马CA1区谷氨酸阳性细胞的N和Aa%比较未见明显差异(t值分别为-0.70,-0.39,P>0.01),见表1;氟虫腈组大脑皮质、海马CA1区的GABA免疫阳性细胞的N和Aa%无明显变化(t值分别为-0.57,-0.53,0.22,-0.21,P>0.05)。

3. 地西泮、苯巴比妥钠的治疗效果:与生理盐水对照组比较, 地西泮治疗组、苯巴比妥钠治疗组小鼠的存活数明显增加(χ²值分别为8.56,8.56,P<0.05), 见表2。对照组小鼠的平均死亡时间为(7.4±5.3)h,地西泮治疗组小鼠的平均死亡时间为(95.0±17.0)h,苯巴比妥钠治疗组小鼠的平均死亡时间为(81.0±11.0)h。地西泮治疗组、苯巴比妥钠治疗组的小鼠平均死亡时间较对照组明显延长(t值分别为8.56,4.89,P<0.05)。

讨论

文献报道,临床氟虫腈中毒患者主要出现易怒、颤抖、四肢抽搐症状,严重时可出现昏迷^[2,3],但有关氟虫腈对机体的急性毒性及中毒机制报道较少。本研究结果显示,小鼠氟虫腈急性中毒的主要表现为中枢神经系统先兴奋后抑制,伴阵发性抽搐,抽搐程度与剂量呈正相关,表现为易激惹、四处奔窜、弓背抬高等,同时伴呼吸急促、心跳加快, 与临床中毒患者出现的症状相似。小鼠中毒后期出现抽搐程度减轻及频率明显减少和懒动、呆滞、反应迟钝等症状。本研究结果表明,一定剂量的氟虫腈可使小鼠发生中毒致死。文献报道氟虫腈急性经口LD₅₀的剂量为54.982mg/kg^[5]。氟虫腈急性小鼠海马的超微结构主要有神经元细胞核膜间隙扩张及胶质细胞空泡化,神经纤维呈早期脱髓鞘改变。海马超微结构的改变是小鼠氟虫腈急性中毒后产生神经系统兴奋症状的病理学基础。海马结构的变化程度与抽搐的严重程度呈正相关,大脑内海马区对抽搐最敏感,癫痫发作均出现上述超微结构变化^[6],尽管海马超微结构的改变特异性不高,但该结果可为进一步对氟虫腈神经毒理方面的深入研究打下基础。另外,急性氟虫腈中毒小鼠大体可见全胃扩张、胃壁变薄。光镜下可见胃窦黏膜层淋巴细胞浸润,推测氟虫腈可引起胃平滑肌松弛,导致胃肠道损害,其机制尚在研究中。

文献报道氟虫腈杀虫机制为氟虫腈与γ-GABA受体结合,有效阻断昆虫中枢神经系统γ-GABA调节的氯离子通道,干扰昆虫中枢神经系统,引起昆虫神经肌肉的过度兴奋直至死亡,氟虫腈也可作用于哺乳动物的γ-GABA受体并造成毒性^[7,8]。谷氨酸和γ-GABA是中枢神经系统内的一对重要的兴奋性和抑制性神经递质,对维持神经细胞兴奋与抑制功能的平衡具有重要作用。一般认为,化学物质兴奋性神经毒性与兴奋性氨基酸递质过度刺激受体或抑制性氨基酸递质功能低下密切相关,谷氨酸兴奋性增强在惊厥抽搐的发生发展中起着重要作用,其含量增加、代谢变化、受体密度增加及结合位点增多等均可引起神经递质兴奋性的变化^[9-12]。研究结果显示,氟虫腈急性中毒后小鼠大脑皮质谷氨酸阳性细胞数、阳性细胞面积比较正常组明显增加,而海马和皮质γ-GABA阳性细胞数、阳性细胞面积比与正常组相比无明显差异,推测氟虫腈急性中毒时可致谷氨酸递质合成增加或过度释放,这可能是造成中枢神经系统兴奋的重要原因。文献报道^[13],大鼠脑内谷氨酸和γ-GABA神经元之间存在着复杂的突触调控关系,一般认为γ-GABA神经元主要起中间神经元作用,γ-GABA神经元可通过树-轴和轴-树突触对谷氨酸神经元进行直接调控。本研究结果表明氟虫腈急性中毒可使谷氨酸表达增强或过度释放,而对γ-GABA表达作用不明显,在氟虫腈急性中毒时,谷氨酸和γ-GABA对中枢神经系统重要的兴奋性和抑制性递质的相互关系尚需深入研究。

迄今为止,对氟虫腈急性中毒尚无文献报道有效的解毒治疗药物,由于其急性中毒机制可能与氟虫腈作用于γ-GABA受体有关,而抑制性神经递质γ-GABA受体是一种膜蛋白,分为GABAA、GABAB和GABAC3种亚型,其中GABAA受体在脑内较多,与Cl^-离子通道耦联组成GABA受体复合物,当受体激动时,Cl^-离子通道打开,引起细胞外Cl^-内流,导致突触后膜超极化,产生神经元的抑制效应。相反,GABA受体阻断剂则通过不同途径间接或直接的影响GABA系统的活动,产生中枢神经系统兴奋效应。所以,我们选择了地西泮和苯巴比妥钠,观察其对氟虫腈急性中毒的治疗作用。地西泮可促进GABA与GABAA受体结合,也可通过增加Cl^-开放频率而增强GABA对GABAA受体的作用,从而显示抗惊厥效应。苯巴比妥钠的中枢作用也与激活抑制性GABAA受体有关,在没有GABA时巴比妥类能模拟GABA的作用,增加Cl^-的通透性,使细胞膜超极化。单通道实验记录证实苯二氮受体类药增加Cl^-通道开放的频率,而巴比妥类药则延长Cl^-通道的开放时间。本实验观察到在治疗氟虫腈急性中毒小鼠的实验中,使用地西泮和苯巴比妥钠均可取得良好疗效,与临床报道氟虫腈治疗的结果相符;但其解毒作用的时效与量效关系、解毒作用是否与阻断Cl^-通道作用有关等方面仍需进一步研究。

参考文献(略)

摘自：中华预防医学杂志2006年5月第40卷第3期192-195